三年連考生物知識點：微生物的分離和培養(2)

　　（二）分離的操作方法

　　1、稀釋分離法

　　通過不斷稀釋使被分離的樣品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板與溫度適合溶化了的瓊脂培養基混合，這樣分散的細菌被固定在原處而形成單菌落。

　　（1）將大腸桿菌或酵母菌用無菌水制作菌懸液。

　　（2）取若干支無菌試管，每支內盛9ml無菌水。

　　（3）吸取1ml制備好的菌懸液，置于第一支含有9ml無菌水的試管內，這樣就稀釋了10倍，也就是10-2。

　　（4）從第一支試管內（10-2）吸取1ml注入第二支含有無菌水的試管內，這樣就稀釋了100倍，也就是10-2。

　　（5）用同樣方法操作，直至稀釋至10-5-10-6。

　　（6）分別精確吸取10-5-10-6各稀釋度菌液0.2ml加入編好號的空無菌平皿中，同一稀釋度重復做三個平皿。

　　（7）將已溶化并冷卻至45℃的瓊脂培養基倒入上述各平皿內，輕輕旋轉使培養基與菌懸液充分混勻，凝固后倒置于37℃或38℃度恒溫箱中培養24-48小時，觀察平板上菌落生長和分布情況。

　　2、平板劃線分離法

　　平板劃線分離法是接種環在平板培養基表面通過分區劃線而達到分離微生物的一種方法。其原理是將微生物樣品在固體培養基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的。

　　（1）倒平板 溶化牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基倒平板，水平靜置待凝。

　　（2）在酒精燈光焰上灼燒接種環，待冷，取一接種環金黃葡萄球菌、大腸桿菌混合菌液。

　　（3）左手握瓊脂平板稍抬起皿蓋，同時靠近火焰周圍，右手持接種環伸入皿內，在平板上一個區域作之形回劃線，劃線時例接種環與平板表面成30-40°角度輕輕接觸，以腕力在表面作輕快的滑動，勿使平板表面劃破或嵌進增基內。

　　（4）灼燒接種杯，以殺滅接種環上尚殘余的菌液，待冷卻后，再將接種環伸入皿內，在第一區域劃過線的地方稍接觸一下后，轉動90°，在第二區域繼續劃線。

　　（5）劃畢后再灼燒接種杯，冷卻后用同樣方法在其他區域劃線。

　　（6）全部劃線完畢后，在平皿底用特種蠟筆注明菌種、日期、組別、姓名。將整個培養皿倒置放入恒溫箱培養。

　　（7）37℃經過24-48小時培養后取出觀察。注意菌落的開關、大小、顏色、邊緣、表面結構、透明度等性狀。

　　附一 無菌操作環節

　　（1）接種室應保持清潔，用煤粉酚皂液擦洗臺面及墻壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。每次使用前，均應用紫外燈滅菌。定期對接種室作無菌程度的檢查。

　　（2）進入接種室前，應先做好個人衛生工作，在緩沖間內要更換工作鞋帽、工作衣、戴口罩。工作衣、工作鞋、口罩只準在接種室內使用。不準穿到其它地方去，并要定期更換、消毒。

　　（3）接種的試管、三角并瓶等應做好標記，注明培養基、菌種的名稱、日期。移入接種室內的所有物品，均須在緩沖室用70%酒精擦試干凈。

　　（4）接種前，雙手用70%酒精或新潔爾消毒，操作過程不離開酒精燈火焰；棉塞不亂放；接種工具使用前后均需火焰滅菌。

　　（5）培養箱應經常清潔消毒。

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